-
Mikroskop confocal mengacu pada semacam mikroskop optik khusus yang dapat merekam irisan optik.
Dengan menerangi dan mengamati titik batas difraksi tunggal, pengiris optik direalisasikan dalam sistem confocal laser. Ini mensyaratkan bahwa dua segmen balok memiliki fokus yang sama, sehingga mereka "confocal". Berlawanan dengan gambar bidang lebar, gambar confocal tidak memiliki blur yang defokus. Ini adalah keuntungan dalam dirinya sendiri, karena citra dalam sampel jelas dan kaya akan detail. Namun, keuntungan terpenting adalah potensi visualisasi tiga dimensi dengan fitur mikroskopis. Setelah urutan gambar diperoleh di sepanjang Z-Stack, objek 3D direkonstruksi dan ditampilkan oleh komputer.
- Iluminasi confocal
Point Light Source Ilumination direalisasikan dengan memfokuskan sumber cahaya pada aperture kecil (lubang jarum) dan kemudian memfokuskannya pada sampel. Ketika aperture cukup kecil, titik iluminasi hanya dibatasi oleh difraksi, bukan oleh parameter geometris dari sumber cahaya dan aperture. Sumber cahaya biasa adalah sumber cahaya permukaan yang besar, sehingga tidak mungkin untuk memfokuskannya pada titik batas difraksi. Oleh karena itu, meskipun transmitansi sangat rendah, cahaya iluminasi terfokus semacam ini masih sangat diperlukan (untuk sumber cahaya tradisional).
Gambar 1: Penerangan untuk pencitraan confocal. Cahaya dari sumber cahaya (LS) difokuskan pada lubang jarum iluminasi (PI) dan kemudian memasuki sampel s ..
Laser sebagai sumber cahaya memiliki kolimasi yang sangat tinggi (cahaya dalam laser yang baik adalah "sangat paralel"). Oleh karena itu, laser dapat difokuskan pada titik terbatas difraksi melalui lensa tunggal tanpa menggunakan lubang jarum. Oleh karena itu, sebagian besar mikroskop confocal tidak memiliki lubang jarum iluminasi. Kualitas titik cahaya tergantung pada kualitas balok laser. Jika kualitasnya tidak bagus, Anda juga dapat memasukkan lubang jarum pencahayaan. Laser biasanya digabungkan ke mikroskop confocal melalui serat optik. Serat -serat ini sendiri juga bertindak sebagai lubang kecil.
Fokus dan kepadatan energi laser yang tinggi menjadikannya sumber cahaya yang ideal untuk mikroskop confocal. Koherensi laser bukanlah fitur yang diperlukan dari kinerja confocal. Sebaliknya, ini merupakan tantangan bagi desainer optik, karena akan menyebabkan pola gangguan palsu, sehingga diperlukan strategi desain yang cermat.
Selain itu, fakta bahwa laser tradisional hanya memancarkan satu warna (laser- "line") memiliki keterbatasannya sendiri. Dalam pencitraan dan pengukuran multi-fluoresensi, diperlukan pengaturan multi-laser yang kompleks. Laser putih dengan terampil memecahkan masalah pencitraan multi-warna.
Gambar 2: Perbandingan confocal (area kanan) dan pencitraan non-konfokal. Di Feulgen Noda Tikus Trofoblas. Banyak informasi gambar non-konfokal tidak berasal dari bidang fokus. Optik confocal menghilangkan semua faktor fuzzy dan membuat strukturnya jelas.
Deteksi confocal
Sebagian besar detektor memiliki area sensitif yang cukup besar (tabung photomultiplier biasanya beberapa sentimeter persegi). Optik confocal perlu penginderaan titik. Oleh karena itu, perlu melakukan deteksi spot dengan memasukkan aperture kecil (lubang jarum) di balok cahaya. Memfokuskan cahaya sampel pada lubang jarum, mengumpulkan dan merekam cahaya yang ditransmisikan.
Karena pola difraksi tergantung pada bukaan numerik dan panjang gelombang, deteksi lubang jarum diperlukan. Oleh karena itu, ketika parameter ini berubah, ukuran lubang jarum harus disesuaikan.
Ketika lensa objektif berubah (biasanya dengan perubahan aperture numerik), mikroskop pemindaian confocal modern akan secara otomatis mengubah diameter lubang jarum secara tepat. Oleh karena itu, lubang kecil biasanya dirancang sebagai lubang ganda atau multi-lapisan.
Faktanya, ukuran lubang jarum yang sesuai tidak hanya tergantung pada panjang gelombang dan aperture numerik, tetapi juga pada pembesaran internal elemen optik dalam mikroskop.
Oleh karena itu, tidak hanya tidak diinginkan tetapi juga salah untuk secara langsung membandingkan diameter lubang jarum dalam mikroskop dengan desain yang berbeda. Jika diameter lubang jarum tidak diatur ke nilai optimal, sistem tidak akan dapat melakukan pengiris optik dengan lancar (yaitu, mengirimkan blur defocus), atau memotong intensitas yang tidak perlu tanpa mendapatkan kualitas pengiris optik lebih lanjut (menghasilkan gambar noise yang tidak perlu).
Gambar 3: Deteksi dalam pencitraan confocal. Cahaya dari sampel S difokuskan pada lubang jaring observasi (PO) dan kemudian pada detektor DE.
Jalur optik pemindaian confocal
Jalur balok confocal dalam sistem pemindaian confocal hanyalah kombinasi iluminasi sumber titik dan deteksi titik. Kombinasi ini dapat digunakan sebagai pisau optik. Hanya foton dari bidang fokus yang dapat ditransmisikan ke sensor. Sementara semua foton dari tempat lain disaring. Piringan optik direalisasikan dengan menggunakan "filter spasial".
Karena hanya satu tempat yang muncul pencitraan "confocal" dalam waktu tertentu, perangkat pemindaian diperlukan untuk memindahkan tempat pada bidang objek dalam mode grid. Biasanya, cermin optik dipasang pada motor pemindaian dan digunakan untuk menjalankan prosedur pemindaian. Ada hambatan dalam waktu yang diperlukan untuk memindai bingkai penuh (biasanya) 1.024 baris. Perbaikan telah dicapai dengan memperkenalkan pemindai berkecepatan tinggi (pemindai resonansi) yang memindai 8, 000 atau lebih banyak baris per detik.
Hanya di bawah teknologi mikroskop dari cahaya yang dipantulkan, irisan optik yang baik dapat dicapai. Ini adalah salah satu alasan pengembangan mikroskop fluoresensi yang kuat dalam 20 tahun terakhir (alasan lain termasuk penemuan imunostaining, hibridisasi DNA, biosensor fluoresen, titik kuantum dan protein fluoresen).
Gambar 4: Dari kiri ke kanan: 1. Kerucut iluminasi tidak hanya menggairahkan pewarna fluoresen di bidang fokus, tetapi juga menggairahkannya ke atas dan ke bawah. Di sini diwakili oleh kerucut ganda hijau. 2. Lubang jarum emisi secara efektif mencegat cahaya yang dipancarkan dari atas bidang fokus. 3. Selain itu, cahaya dari bawah bidang fokus tidak akan melewati lubang jarum. 4. Dalam sistem confocal, hanya cahaya dari sampel yang akan mencapai detektor. Mendeteksi lubang kecil akan secara efektif menolak cahaya apa pun dari area lain. Akhirnya, bagian optik nyata diperoleh.
